Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 6

Wykorzystano zmobilizowane próbki krwi obwodowej od osób kontrolnych i próbki krwi obwodowej CML w celu oczyszczenia komórek CD34 +, najpierw przy użyciu zestawu MicroBead MACS CD34 (Miltenyi Biotec), a następnie sortowania komórek w celu uzyskania 95% czystych komórek CD34 + utrzymywanych w pożywce RPMI z 10% surowicą płodową. Linie komórkowe
Użyliśmy ludzkich komórek hematopoetycznych linii nowotworowych K562, HEL, Daudi, DU528, Jum2, Karpas299, OPM2 i DOHH2 (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli w dodatkowym dodatku). Komórki hodowano w pożywce RPMI z 10% płodową surowicą cielęcą. Komórki mysie BaF3 wyrażające receptor trombopoetyny (BaF3-TpoR) hodowano w pożywce RPMI z 10% surowicą płodową cielęcą zawierającą ng na mililitr rekombinowanej interleukiny-3.
Leczenie uszkodzeń DNA
Komórki napromieniano 5 Gy z użyciem źródła cezu lub traktowano 50 .M etopozydu w dimetylosulfotlenku (DMSO) we wskazanym czasie. Nośnik DMSO dodano do komórek kontrolnych.
Immunoblot i miary pH i apoptozy
Analizy te przeprowadzono jak opisano wcześniej.14 Wewnątrzkomórkowe pH mierzono za pomocą barwnika wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową.
Transfekcja i transfuzja retrowirusowa
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej od pacjentów z CML transfekowano za pomocą plazmidowego NHE-1, wewnętrznego białka aktywowanego fluorescencyjnie z wejściem do rybosomu (pNHE-1-IRES-EGFP) z użyciem zestawu Nucleofector (K562) (Amaxa Biosystems). Komórki GFP-dodatnie sortowano za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego FACSAria (BD Biosciences). Wektory retrowirusowe oparte na mysich komórkach macierzystych-IRES-GFP MIG-BCR-ABL, MIG-Jak2v617f i MIG-NPM-ALK transfekowano do linii komórkowej Phoenix za pomocą Lipofectamine (Invitrogen) i zebrano supernatanty hodowli 24 godziny później. Wirusowe zakażenie komórek Baf3-TpoR przeprowadzono przez spinokulację (1200 g przez 90 minut w 30 ° C). Komórki GFP-dodatnie hodowano w pożywce RPMI z 10% surowicą płodową i sortowano 2 dni później za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem cytometru przepływowego FACSAria.
Analiza statystyczna
Wszystkie analizy statystyczne wykonaliśmy przy użyciu testu t-Studenta. Wszystkie wartości P są dwustronne. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za wskazującą na istotność statystyczną.
Wyniki
Uszkodzenie DNA
Aby ocenić aktywność szlaku NHE-1-Bcl-xL w prawidłowych komórkach szpikowych, zbadaliśmy wpływ uszkodzenia DNA na oczyszczone granulocyty z krwi obwodowej od zdrowych osobników kontrolnych. Zarówno etopozyd, jak i napromieniowanie zwiększały poziom NHE-1, wewnątrzkomórkowe pH, deamidację Bcl-xL oraz odsetek komórek apoptotycznych, wyniki zgodne z wynikami o tymocytach myszy, które opisano wcześniej.14 Nie ma jednak powtarzalnych zmian w podstawowym NHE -1 poziomy były widoczne (rysunek 1A i rysunek 2 w dodatkowym dodatku). W wyraźnym przeciwieństwie, nie widzieliśmy takich reakcji na uszkodzenie DNA w granulocytach od pacjentów z CML niosących kinazę tyrozynową BCR-ABL (Figura 1A i 1B)
[więcej w: stomatolog zielona góra, stomatolog płock, stomatologia Kraków ]

Powiązane tematy z artykułem: stomatolog płock stomatolog zielona góra stomatologia Kraków