Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 10

Jednak nie jest jasne, dlaczego komórki macierzyste od pacjentów z przewlekłą fazą CML i czerwienicą prawdziwą są podatne na gromadzenie uszkodzeń DNA. 29 Normalne komórki przechodzą wiele pęknięć nici DNA na genom na podział komórkowy i odpowiednie mechanizmy naprawy DNA w połączeniu z usuwaniem komórek uszkodzonych przez apoptozę, są zatem niezbędne do homeostazy.31 Hamowanie szlaku dezamidacji Bcl-xL w przewlekłej fazie CML i czerwienicy prawdziwej zapewnia mechanizm obchodzenia odpowiedzi apoptotycznej i umożliwiający akumulację uszkodzeń DNA w obrębie złośliwego klonu. Doniesiono, że komórki wykazujące ekspresję onkogennych kinaz tyrozynowych, w tym BCR-ABL, są oporne na uszkodzenie DNA. 32-34 Oporność na czynniki uszkadzające DNA zależy od aktywności katalitycznej BCR-ABL.32 Zgodnie z tym odkryciem, połączenie chemioterapii antyluankowej z inhibitorem kinazy tyrozynowej imatynib powoduje zwiększoną lub synergiczną apoptozę.35-38 Nasze wyniki rzucają światło na molekularne podstawy skuteczności takich terapii skojarzonych. Hamowanie BCR-ABL przez imatinib jest związane ze zwiększonym poziomem proapoptotycznych białek tylko BH3, takich jak Bim i Bad.39-41. Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 10”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 9

Dlatego też przebadaliśmy pacjenta, który stał się odporny na imatynib w wyniku mutacji E255V w domenie kinazy BCR-ABL. PBMCs traktowane imatynibem od tego pacjenta nie wykazywały podwyższonych poziomów NHE-1 w odpowiedzi na deamidację etopozydu lub Bcl-xL w odpowiedzi na etopozyd lub naświetlanie (Figura 4A i 4B). Jednakże, działanie oporności na imatynib można ominąć przez nadekspresję NHE-1, która spowodowała zwiększenie wewnątrzkomórkowego pH i apoptozy (Figura 4C i 4D) lub przez wymuszoną alkalizację, co spowodowało zwiększoną dezamidację i apoptozę Bcl-XL (Figura 12 w Dodatku Dodatek). Dane te wykazują, że aktywność kinazy BCR-ABL jest niezbędna do hamowania szlaku dezamidacji Bcl-xL w komórkach CML. Dyskusja
Deamidacja wewnętrznych reszt asparaginowych lub glutaminowych może mieć głęboki wpływ na funkcję białek i bierze udział w wielu procesach biologicznych. Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 9”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 8

Dane te sugerują, że szlak pozostaje hamowany po transformacji białaczkowej, co zostało potwierdzone przy użyciu blaszek od pacjenta z CML w czasie przełomu blastycznego (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do tego, ścieżka była nienaruszona w czterech innych liniach komórkowych, które nie są uważane za ekspresjonujące onkogenne kinazy tyrozynowe (Tabela i Figura 8 w Dodatku Uzupełniającym). Ścieżka była również nienaruszona w linii komórkowej T-chłoniaka (Karpas-299), która eksprymuje białko fuzyjne kinazy tyrozynowej NPM-ALK oraz w linii komórkowej szpiczaka (OPM-2), która nadmiernie zwiększa receptor czynnika wzrostu fibroblastów 3 ( FGFR3) kinaza tyrozynowa. Te wyniki sugerują, że hamowanie szlaku dezamidacji Bcl-xL nie jest ogólną cechą nowotworów hematologicznych i jest mediowane przez podgrupę kinaz tyrozynowych lub jest zależne od konkretnego kontekstu komórkowego. Aby zbadać, czy na hamowanie szlaku NHE-1-Bcl-xL wpływa siła kinaz, przeprowadziliśmy serię eksperymentów z użyciem linii komórkowej Baf3-TPoR transdukowanych kinazami tyrozynowymi BCR-ABL, JAK2 V617F lub NPM-ALK, dając wzrost do kilku populacji komórek o różnych poziomach ekspresji kinazy (Figura 9 w Dodatku Aneks). Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 8”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 7

Zarówno etopozyd, jak i napromieniowanie powodowały istotnie mniejszą apoptozę w granulocytach CML niż w prawidłowych granulocytach (ryc. 1C), co było zgodne z genotoksyczną opornością na komórki BCR-dodatnie z dodatnim wynikiem testu BCR-8. W przeciwieństwie do tego, limfocyty T od tych samych pacjentów z CML nieodporny na alkalizację, deamidację Bcl-XL i apoptozę wywołaną uszkodzonym DNA (Rysunek 3 w Dodatku Uzupełniającym). Aby zbadać poziom, na którym szlak deamidacji NHE-1-Bcl-xL został zablokowany w komórkach CML, eksponowaliśmy granulocyty od pacjentów z CML na różne poziomy zewnętrznego pH. Wzmocniona alkalizacja odwróciła hamowanie i przywróciła deamidację Bcl-xL i apoptozę nawet przy braku uszkodzenia DNA, co sugeruje, że blok był na poziomie antyportu NHE-1 (Figura 4 w Dodatkowym dodatku). Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 7”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 6

Wykorzystano zmobilizowane próbki krwi obwodowej od osób kontrolnych i próbki krwi obwodowej CML w celu oczyszczenia komórek CD34 +, najpierw przy użyciu zestawu MicroBead MACS CD34 (Miltenyi Biotec), a następnie sortowania komórek w celu uzyskania 95% czystych komórek CD34 + utrzymywanych w pożywce RPMI z 10% surowicą płodową. Linie komórkowe
Użyliśmy ludzkich komórek hematopoetycznych linii nowotworowych K562, HEL, Daudi, DU528, Jum2, Karpas299, OPM2 i DOHH2 (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli w dodatkowym dodatku). Komórki hodowano w pożywce RPMI z 10% płodową surowicą cielęcą. Komórki mysie BaF3 wyrażające receptor trombopoetyny (BaF3-TpoR) hodowano w pożywce RPMI z 10% surowicą płodową cielęcą zawierającą ng na mililitr rekombinowanej interleukiny-3.
Leczenie uszkodzeń DNA
Komórki napromieniano 5 Gy z użyciem źródła cezu lub traktowano 50 .M etopozydu w dimetylosulfotlenku (DMSO) we wskazanym czasie. Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 6”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 5

Próbki traktowano etopozydem (Etop) przez 3, 6 lub 9 godzin, jak pokazano, a następnie ekspresję NHE-1 oceniano metodą immunoblottingu. Względne wartości oceny ilościowej (znormalizowane dla kontroli załadowania tubuliny) są pokazane. W panelu B imatinib nie odwraca hamowania wywołanej uszkodzeniem DNA dezamidacji Bcl-xL w komórkach CML opornych na imatynib. PBMC hodowane z imatinibem lub bez niego, jak opisano w Tablicy A, traktowano etopozydem lub napromieniowaniem (IR). Komórki zebrano i poddano obróbce pod kątem immunoblottingu Bcl-xL lub tubuliny (kontrola obciążenia). Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 5”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych czesc 4

Wpływ Imatinibu lub inhibitorów JAK2 na regulację w górę NHE-1 i deamidację Bcl-xL w komórkach CML wywołanych uszkodzeniem DNA. W Panelu A, oczyszczone komórki CD34 + od pacjenta z CML i mobilizowanym czynnikiem stymulującym kolonię granulocytów, komórki krwi obwodowej od osobnika kontrolnego traktowano etopozydem (Etop) przez 24 godziny, a podwielokrotności komórek następnie przetwarzano pod kątem NHE-1 i Immunoblot Bcl-xL. Actin został powtórzony jako kontrola obciążenia. Dane reprezentują trzy oddzielne eksperymenty. W panelu B podwielokrotności komórek użytych do analizy pokazanej w panelu A oceniono pod względem wewnątrzkomórkowego pH. Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych czesc 4”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych cd

Pokazano średnią (. SD) wartości od 6 osób kontrolnych i 10 pacjentów z CML. Pojedyncza gwiazdka oznacza P> 0,05, a podwójna gwiazdka oznacza P <0,001. W panelu D nadekspresja antyportu NHE-1 powoduje dezamidację Bcl-xL w komórkach CML. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od pacjentów z CML były nieleczone lub były transfekowane pustym wektorem lub plazmidem NHE-1 wewnętrznym wzmocnionym miejscem wiązania rybosomalnego białka o zielonej lokalizacji (wektor NHE-1) z użyciem zestawu Nucleofector (Amaxa Biosystems). Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych cd”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad

Związek z nowotworzeniem został zasugerowany przez obserwację, że normalna reakcja szlaku NHE-1-Bcl-xL na uszkodzenie DNA została zniesiona w mysim modelu chłoniaka z limfocytów T.13,14 Teocyty transformowane aktywowaną tyrozyną Lck kinaza nie była zdolna do odpowiedzi na uszkodzenie DNA przez zwiększenie poziomów NHE-1, deamidację Bcl-XL lub apoptozę. Hamowanie szlaku NHE-1-Bcl-xL nie wydaje się być ogólną cechą raka, ponieważ deamidacja Bcl-xL indukowana przez uszkodzone DNA jest nienaruszona w liniach komórkowych kostniakomięsaka i raka szyjki macicy, pęcherza moczowego i jajnika12,15. oraz w pierwotnych przewlekłych białaczkach limfocytowych.14 Ponieważ nie wyjaśniono znaczenia dezamidacji Bcl-xL dla ludzkich nowotworów związanych z aktywowanymi kinazami tyrozynowymi, zbadaliśmy szlak dezamidacji Bcl-xL w komórkach od pacjentów z CML i czerwienicą prawdziwą. Metody
Odczynniki i przeciwciała
Otrzymaliśmy etopozyd, jodek propidyny i nigerycynę z Sigmy; SNARF-1 od Molecular Probes; imatinib od Novartis; Inhibitor JAK od Calbiochem; i inhibitory JAK2 TG101209 i AT9283 z Astex Therapeutics. Do analizy Western blot wykorzystano przeciwciała Bcl-xL (610212) i NHE-1 (klon 54) z BD Transduction Laboratories i .-aktyny i .-tubuliny z Sigma. Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad”

Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych

Zaburzenia mieloproliferacyjne są zaburzeniami klonalnymi z częstymi zmianami somatycznego wzmocnienia funkcji wpływającymi na kinazy tyrozynowe. W tych chorobach dochodzi do wzrostu uszkodzenia DNA i ryzyka progresji do ostrej białaczki. Mechanizmy molekularne w zaburzeniach mieloproliferacyjnych, które zapobiegają apoptozie wywołanej uszkodzonym DNA, są niejasne. Metody
Szukaliśmy nieprawidłowości proapoptotycznego szlaku dezamidacji Bcl-xL w komórkach pierwotnych od pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową (CML) lub czerwienicą prawdziwą, zaburzeniami mieloproliferacyjnymi związanymi z kinazą fuzyjną BCR-ABL i mutacją Janus tyrozyna 2 (JAK2) V617F, odpowiednio.
Wyniki
Szlak dezamidacji Bcl-xL był hamowany w komórkach mieloidalnych, ale nie w komórkach T, u pacjentów z CML lub czerwienicą prawdziwą. Continue reading „Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych”