Hamowanie szlaku deamidacji Bcl-xL w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 5

Próbki traktowano etopozydem (Etop) przez 3, 6 lub 9 godzin, jak pokazano, a następnie ekspresję NHE-1 oceniano metodą immunoblottingu. Względne wartości oceny ilościowej (znormalizowane dla kontroli załadowania tubuliny) są pokazane. W panelu B imatinib nie odwraca hamowania wywołanej uszkodzeniem DNA dezamidacji Bcl-xL w komórkach CML opornych na imatynib. PBMC hodowane z imatinibem lub bez niego, jak opisano w Tablicy A, traktowano etopozydem lub napromieniowaniem (IR). Komórki zebrano i poddano obróbce pod kątem immunoblottingu Bcl-xL lub tubuliny (kontrola obciążenia). Procenty zdeamidowanego Bcl-xL obliczono jak opisano na Figurze 1A i pokazano wartości. W panelu C nadekspresja NHE-1 powoduje deaminację Bcl-xL w komórkach CML opornych na imatynib. PBMC od pacjenta z CML opornym na imatynib nie były leczone lub były transfekowane pustym wektorem lub pNHE-1-IRES-EGFP (wektor NHE-1) przy użyciu zestawu Nucleofector (Amaxa Biosystems). Komórki zawierające GFP zostały następnie posortowane i poddane immunoblottingowi pod kątem NHE-1 lub Bcl-xL. Tubulina została powtórzona jako kontrola obciążenia. Wartości densytometryczne, które znormalizowano pod względem obciążenia białkiem, pokazano pod immunoblotami. W panelu D nadekspresja NHE-1 powoduje alkalizowanie wewnątrzkomórkowe i apoptozę w komórkach CML opornych na imatynib. Wewnątrzkomórkowe wartości pH i sub-G1 zmierzono jak opisano na Figurze 1B i 1C. Pobraliśmy próbki krwi obwodowej od pacjentów z CML lub czerwienicą prawdziwą i od zdrowych osób kontrolnych. Wszystkie podmioty wyraziły pisemną świadomą zgodę. Badanie zostało zatwierdzone przez komitet etyki Cambridge and Eastern Region. Spośród 10 próbek CML, dla których dane przedstawiono na ryc. 1, 6 pochodziło od pacjentów ze świeżo zdiagnozowaną CML w fazie przewlekłej, pochodziło od pacjenta w fazie przyspieszonej, a 3 pochodziło od pacjentów w fazie przewlekłej, którzy otrzymywali terapię. Wszyscy pacjenci z czerwienicą prawdziwą, których dane przedstawiono na rycinie 2, mieli stabilną, nietransformowaną chorobę i otrzymywali terapię hydroksymocznikiem w czasie pobierania krwi. Sześciu pacjentów z CML, których dane przedstawiono na rycinie 3, miało nowo zdiagnozowaną CML w fazie przewlekłej, a pacjent z mutacją oporności na imatinib (E255V) na Figurze 4 był w fazie przyspieszonej. Wszyscy pacjenci z CML mieli przegrupowanie BCR-ABL; pacjenci z czerwienicą prawdziwą i idiopatyczną mielofibrozą otrzymali diagnozę na podstawie kryteriów, które zostały wcześniej zgłoszone2. Ilościowy test pirosekwencjonowania dla mutacji JAK2 V617F przeprowadzono jak opisano wcześniej.16
Oczyszczanie komórek
Próbki krwi obwodowej od pacjentów i osobników kontrolnych odwirowano za pomocą Lymphoprep (Axis-Shield PoC), a następnie komórki w peletkach (granulocytach) lub interfazie (komórki jednojądrzaste krwi obwodowej [PBMCs] zebrano do dalszych eksperymentów. Mieloidalne pochodzenie PBMC i czystość populacji granulocytów sprawdzono przez barwienie przeciwciałami monoklonalnymi CD2, CD3 i CD19, sprzężonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny, razem z CD13-PE i CD14-APC, a następnie cytometrią przepływową. Spośród PBMC, 85 do 95% było pochodzenia mieloidalnego, a granulocyty były czyste w ponad 90%
[przypisy: blog o odchudzaniu z przepisami, ferrytyna badanie cena, leki przeciwbólowe na receptę lista ]

Powiązane tematy z artykułem: blog o odchudzaniu z przepisami ferrytyna badanie cena leki przeciwbólowe na receptę lista